摘要 同源重组修复是高度保真的DNA双链断裂的修复方式。同源重组修复基因检测对于前列腺癌患者的肿瘤遗传风险评估、治疗决策、预后判断等方面均具有重要意义，涉及适用人群、样本选择、样本处理要求、变异解读与报告等诸多环节。为指导和规范前列腺癌同源重组修复基因检测，中华医学会病理学分会、中华医学会泌尿外科学分会和国家病理质控中心联合制定本共识。 正文 DNA损伤应答是机体应对各种内源性或外源性因素造成的DNA损伤的修复系统，其中同源重组修复（homologous recombination repair，HRR）是高度保真的DNA双链断裂（double-strand break，DSB）的修复方式。国内外指南已推荐转移性去势抵抗前列腺癌（metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC）患者进行肿瘤HRR基因检测以指导临床治疗。前列腺癌HRR基因检测涉及多个基因、多种变异类型，主要采用下一代测序（next generation sequencing，NGS）技术。目前，前列腺癌HRR基因检测在产品设计、质控、检测过程、结果解读等环节仍然存在诸多挑战，临床检测质量参差不齐。基于此，中华医学会病理学分会、中华医学会泌尿外科学分会和国家病理质控中心共同制定本共识，以规范前列腺癌HRR基因检测流程，提升检测质量。 一、前列腺癌HRR基因突变 大多数的DNA损伤可以通过DNA损伤应答得到及时有效的修复。DNA双链断裂是严重的DNA损伤，其修复主要依赖于HRR。HRR以同源DNA序列作为模板合成新的DNA序列，该过程高度保真并需要多种关键蛋白（BRCA1、BRCA2、ATM、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCL、PALB2、RAD51B/C/D、RAD54L等）参与。在同源重组缺陷（homologous recombination deficiency，HRD）时，细胞通过非同源末端连接（non-homologous end-joining，NHEJ）的方式直接连接DNA双链断裂的末端来介导修复过程，这一过程可能引起断裂位点或周围DNA序列的缺失或突变，造成基因组不稳定。25%~30%的前列腺癌患者携带有HRR基因突变，HRR基因突变中约半数为胚系突变。De Bono等研究发现27.9%的mCRPC患者存在HRR基因突变。 二、前列腺癌中HRR基因检测的临床意义 1. HRR基因突变与前列腺癌患病风险相关：携带BRCA1/2及其他HRR基因（ATM、PALB2、CHEK2）胚系突变的男性罹患前列腺癌的风险显著提高。BRCA2胚系突变携带者罹患前列腺癌的相对危险度（RR）为2.5~4.6，55岁以前患病的RR为8~23；BRCA1胚系突变携带者65岁以前发生前列腺癌的RR为1.8~3.8；ATM胚系突变携带者发生转移性前列腺癌的RR为6.3。 2. HRR基因突变与前列腺癌预后相关：存在HRR基因胚系突变的前列腺癌患者病情进展快，预后差。前列腺癌特异性死亡患者中BRCA1/2和ATM胚系突变的发生率显著高于局限期前列腺癌患者（6.07%∶1.44%，P=0.001），BRCA1/2和ATM胚系突变是前列腺癌不良预后的独立预测因素（HR=2.13，95%CI：1.24~3.66，P=0.004）。另一项前瞻性队列研究发现，相较于野生型患者，ATM/BRCA1/BRCA2/PALB2基因胚系突变前列腺癌患者的肿瘤特异性生存时间明显缩短（中位肿瘤特异性生存时间22.3个月∶33.2个月），BRCA2突变患者的中位肿瘤特异性生存时间仅为野生型患者的一半（17.4个月∶33.2个月）。 3. HRR基因突变与前列腺癌PARP抑制剂治疗疗效相关：近年来，越来越多的临床研究证实了PARP抑制剂在mCRPC患者治疗中的价值。TRITON2、GALAHAD及TOPARP-B等多项Ⅱ期临床研究均发现携带DDR基因（绝大多数为HRR基因）功能缺失性胚系或体细胞突变的mCRPC患者对PARP抑制剂敏感。PROfound研究证实奥拉帕利能够显著改善HRR基因胚系或体细胞突变mCRPC患者的影像学进展、全因死亡和疼痛进展等多个关键临床结局，奥拉帕利作为HRR突变mCRPC患者的标准治疗方案已被国内外多个权威指南推荐。 三、HRR基因检测适用人群 《美国国立综合癌症网络（NCCN）临床实践指南：前列腺癌（2022年第4版）》推荐所有转移性前列腺癌患者进行肿瘤样本HRR基因突变检测以指导治疗；对于有肿瘤家族史或高风险胚系突变（如BRCA1/2）家族史、局限期高危和极高危、局部晚期、转移性患者进行胚系HRR基因和DNA错配修复基因检测。《中国泌尿外科前列腺癌诊断治疗指南2021版》和《中国临床肿瘤学会（CSCO）前列腺癌诊疗指南2022版》推荐前列腺癌患者进行基因检测以制定治疗决策和提供遗传咨询，当以制定治疗决策为目的时，Ⅰ级推荐所有转移性前列腺癌患者进行HRR基因的胚系以及体细胞基因检测；而当以遗传咨询为目的时，Ⅰ级推荐具备相关家族史的患者行BRCA1/2等HRR基因和错配修复基因的胚系基因检测。 基于国内外指南推荐、临床证据和国内检测实践，经专家组讨论，对于HRR基因检测适用人群，按照不同的检测目的，分别作出推荐。 1. 以评估遗传风险为目的时：推荐对高危、极高危、局部晚期、转移性前列腺癌患者进行胚系突变检测（Ⅰ级推荐）；推荐对具有特定肿瘤家族史、乳腺癌病史或家系已知HRR基因致病/可能致病性变异的极低危、低危、中危前列腺癌患者进行胚系突变检测（Ⅰ级推荐）；推荐对具有胰腺癌、黑色素瘤、结直肠癌、胃癌、胆管癌、小肠癌、胶质母细胞瘤或上尿路尿路上皮癌病史的极低危、低危、中危前列腺癌患者进行胚系突变检测（Ⅱ级推荐）；推荐对具有导管内癌或导管腺癌成分的前列腺癌患者进行胚系突变检测（Ⅱ级推荐）。建议在胚系突变检测前后对患者进行遗传咨询。检测基因至少包括BRCA1、BRCA2、ATM、PALB2、CHEK2、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2。 2.以制定治疗决策为目的时：推荐对转移性去势抵抗前列腺癌患者进行肿瘤检测（Ⅰ级推荐）；推荐对转移性去势敏感前列腺癌患者进行肿瘤检测（Ⅱ级推荐）；推荐对局部晚期前列腺癌患者进行肿瘤检测（Ⅲ级推荐）。检测的HRR基因至少包括：BRCA1、BRCA2、ATM、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCL、PALB2、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54L。 四、HRR基因检测样本选择 前列腺癌患者的HRR基因突变可以为胚系突变（来自生殖细胞，可遗传至后代），也可以为体细胞突变（局部组织中突变，促进肿瘤发生发展）。胚系突变可从血液白细胞/口腔黏膜等正常细胞样本以及肿瘤组织/血浆循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）等肿瘤细胞相关样本中检出，体细胞突变仅能从肿瘤组织/ctDNA等肿瘤细胞相关样本中检出。 在PROfound临床研究中，组织样本检测存在1/3的失败率，失败的主要原因包括病理质控不合格、肿瘤细胞含量较少、DNA提取量不足、DNA质量不满足后续检测的质控要求。前列腺癌患者进展至mCRPC阶段的病程通常较长，存档时间长的样本DNA降解严重，5年以上的存档样本检测失败率超过50%。 机体内凋亡或坏死的细胞可释放游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）进入血液循环，肿瘤细胞释放进入血液中的游离DNA称为ctDNA。ctDNA检测作为一种无创的检测方法，能够反映肿瘤组织中的基因突变信息，在临床中的应用越来越广泛。ctDNA检测的灵敏度与血浆中的ctDNA丰度相关，前列腺癌患者血浆中的ctDNA的丰度与疾病分期、肿瘤负荷、前列腺特异性抗原水平等密切相关。局限期前列腺癌患者血浆ctDNA丰度低，血浆ctDNA检测不能发现所有临床有意义的突变；但转移性前列腺癌患者的血浆与组织样本检测结果一致性较高，PROfound及TRITON2/3回顾性分析表明，mCRPC患者组织和血浆配对样本的检测结果一致度为82%~91%。此外，血浆ctDNA还可应用于动态监测HRR基因突变状态，在PARP抑制剂治疗反应预测、耐药机制检测等方面有重要的应用前景。 基于以上证据，经专家组讨论，对前列腺癌患者HRR基因检测（以制定治疗决策为目的）的样本选择作出如下推荐： 若患者有符合病理质控要求的组织样本（建议采用保存时间在2年以内的组织样本，详见“HRR基因检测的样本处理要求”），推荐进行组织样本检测（Ⅰ级推荐）。若患者无合格的存档样本，或组织样本检测失败，推荐进行血浆ctDNA样本检测（Ⅰ级推荐）。若患者ctDNA检测失败，可进行血液白细胞样本检测以发现可能的胚系突变（Ⅰ级推荐）。组织样本、血浆ctDNA样本、血液白细胞样本检测成功均可用于指导临床治疗决策（图1）。 五、HRR基因检测样本处理要求 样本质量合格是检测成功的前提，结合临床实践，本共识对于各类样本的取材及处理要求如下： 1.血液样本处理要求（胚系突变检测）：参见《基于下一代测序技术的BRCA1/2基因检测指南（2019版）》。 2.血浆样本处理要求（ctDNA检测）：采集8~10 mL全血，在采集血液样本时应避免溶血，采集时推荐使用含有稳定剂的专用常温采血管，可稳定外周血白细胞不发生降解，不影响cfDNA的浓度和质量。若采集时使用EDTA-K3抗凝管，需在6 h内对血液样本进行血浆分离处理。推荐通过2次离心进行血浆分离处理：第1次1 600×g离心10 min，取离心后上清，尽量避免触碰沉淀；将上清液进行第2次离心（16 000×g，10 min）。血浆分离后，如不能立即进行cfDNA提取，可放置在-20 ℃或-80 ℃条件下，可分别保存1个月或1年时间；如果可以提取，可暂时在4 ℃保存不超过3 h，应避免血浆样本反复冻融超过2次。 3.组织样本处理要求：参见《基于下一代测序技术的BRCA1/2基因检测指南（2019版）》。若存档样本检测失败，必要时可在取得患者充分知情同意的情况下再次穿刺以重新获取组织样本。50%以上前列腺癌患者可出现骨转移，而骨转移灶含有大量钙盐，会影响常规方法制作切片，需经酸处理除去钙盐。但脱钙处理会破坏组织和DNA，建议尽可能进行不脱钙的标准石蜡包埋处理。必须要脱钙时，推荐在中性甲醛固定后使用弱酸处理（如甲酸脱钙），脱钙过程中可以通过细针轻扎检测脱钙程度，避免脱钙时间过长。 六、HRR基因检测技术与流程 HRR通路涉及多个基因，且HRR基因缺乏热点突变，因而HRR基因突变检测一般采用NGS技术。美国食品药品监督管理局（FDA）已批准Foundation One CDx及Foundation One CDx liquid分别应用于组织样本及血浆样本的HRR基因突变检测，作为mCRPC患者使用奥拉帕利治疗的伴随诊断。我国国家药品监督管理局（NMPA）尚未批准相关伴随诊断试剂盒。HRR基因检测需要采用经过充分性能验证（包括精准性、准确性、分析灵敏度、分析特异度、稳定性、检测范围等）的检测方法；检测基因需至少覆盖药监部门批准和指南共识中推荐的HRR基因；探针设计需覆盖这些基因的全部外显子区域，以及与外显子交界的内含子区域（外显子上下游±20 bp）；检测变异类型需覆盖单核苷酸变异、小片段插入缺失、拷贝数变异等。 基于NGS技术的基因检测流程可以分为6个环节，即样本获取及处理、核酸抽提、文库构建、上机测序、数据分析、变异解读及报告。本共识主要结合前列腺癌HRR基因检测的特点介绍核酸抽提、文库构建、上机测序及数据分析环节。 1.核酸抽提：不同的方法在提取DNA效率方面存在较大差异，尤其是提取血浆cfDNA。有研究比较使用不同的血浆cfDNA提取试剂，同一份样本血浆cfDNA提取量的范围在1.6~28.1 μg/L。实验室应当重视cfDNA提取过程，评估提取试剂的有效性，不可使用人基因组DNA提取试剂进行cfDNA提取。血浆样本cfDNA提取后，可进行片段分布分析，以监测是否存在基因组DNA污染。 2.文库构建：组织样本在核酸提取后，需要先通过超声打断法或者非特异性核酸内切酶消化法，对基因组DNA进行片段化处理。片段化后的DNA样本通过凝胶电泳或磁珠吸附以筛选合适大小的DNA片段并进行下一步文库构建。血浆样本不需要进行DNA片段化处理。靶向测序文库构建主要有两种方法，靶向扩增子建库和目标序列杂交捕获。文库构建的质量可从文库片段大小、文库浓度、文库的转化率和复杂度4个方面进行评价。 3.NGS测序及数据分析：构建好的文库在高通量测序仪上进行上机测序，测序完成后需要对原始数据进行质控和生物信息分析。质控参数一般包括碱基质量值Q30占比、比对回帖率、平均测序深度、中位测序深度等。本共识推荐的NGS测序中质量评估参数及建议质控标准参见表1。 表1 下一代测序质量评估参数及建议质控标准 七、HRR基因变异解读 HRR基因变异命名可参考人类基因组变异学会（Human Genome Variation Society，HGVS）命名法。HRR基因变异解读可参考的指南或标准包括：美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）和美国分子病理学会（Association for Molecular Pathology，AMP）在2015年发布的序列变异解读标准和指南及更新的细则，该指南主要应用于胚系变异解读（下称胚系变异解读指南）；美国分子病理学会（AMP）、美国临床肿瘤学会（American Society of Clinical Oncology，ASCO）和美国病理学家学会（College of American Pathologists，CAP）在2017年联合发布的肿瘤序列变异解读和报告标准的指南，该指南主要应用体细胞变异解读（下称体细胞变异解读指南）。BRCA1/2基因解读还可参考的标准/指南包括《BRCA1/2数据解读中国专家共识（2021版）》，欧洲分子基因诊断质量联盟（European Molecular Genetics Quality Network，EMQN）遗传性乳腺癌/卵巢癌分子遗传分析最佳实践指南和ENIGMA BRCA1/2基因变异分类标准等。 胚系变异解读指南关注变异对于某种遗传疾病的致病性，根据人群数据库信息、变异位点信息、文献人群数据、功能研究数据、共分离数据、等位基因数据、表型数据和计算机预测数据等证据将胚系变异按照致病风险程度由高到低分为以下5类：致病性（5类，致病可能性>0.99）、可能致病性（4类，致病可能性在0.95~0.99）、意义未明（3类，致病可能性在0.05~0.949）、可能良性（2类，致病可能性在0.01~0.049）和良性（1类，致病可能性<0.01）。致病/可能致病性变异主要包括以下几种情况：（1）无义突变和移码突变：该类变异造成终止密码子提前出现，产生截短蛋白，统称为截短变异。需要注意的是，BRCA2基因截短变异必须发生在第3 309位氨基酸之前，BRCA1基因截短变异必须发生在第1 855位氨基酸之前；其他基因最大截短位点可参考对应基因已知的致病性/可能致病性截短变异以及终止密码子提前出现且预测会触发无义介导的mRNA降解（Nonsense-mediated mRNA decay，NMD）的位置，取最靠近3′端的位点。（2）剪切位点变异：发生在外显子上下游第一或第二个碱基的变异（排除经预测或已明确的可产生可能恢复基因功能的自发框内RNA异构体变异）以及经mRNA水平实验证实影响剪接的变异。（3）起始密码子变异：该类变异造成密码子的丢失，但需排除意义未明变异及有证据显示或预测有其他替代性可起始翻译有功能蛋白的变异。（4）大片段重排：该类变异包括一个或多个外显子的缺失、重复、倒位或易位等，且造成一个或多个具有重要功能的外显子丢失、蛋白截短或NMD现象。（5）导致蛋白功能缺失的错义突变以及小片段框内插入/缺失变异：需根据上述胚系变异解读指南中的多项证据累加后判定为致病/可能致病性变异。 体细胞变异解读指南关注变异对临床实践的影响，根据对疾病诊断、治疗或预后的影响，将变异分为以下4个等级（表2）：临床意义明确（Ⅰ级）、有潜在临床意义（Ⅱ级）、临床意义不明确（Ⅲ级）和良性或可能良性突变（Ⅳ级）。 表2 体细胞变异分级标准 经专家组讨论，为了简化前列腺癌中HRR基因变异解读，本共识推荐对前列腺癌中检出的HRR基因体细胞变异根据临床意义分为4个层级，指导临床治疗决策： 1. Ⅰ级，临床意义明确的变异：BRCA1、BRCA2、ATM、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCL、PALB2、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54L基因的致病或可能致病性变异（FDA已批准奥拉帕利用于治疗携带HRR基因突变的mCRPC患者，卢卡帕利用于治疗携带BRCA1/2基因突变的mCRPC患者，A级证据）。 2. Ⅱ级，具有潜在临床意义的变异：其他HRR基因致病或可能致病性的变异（如作为临床研究中筛选入组标准的基因FANCA、NBN、ATR、HDAC2、MRE11等，建议参考具体药物和临床研究信息）。 3. Ⅲ级，临床意义未明的HRR基因变异。 4. Ⅳ级，良性或可能良性的HRR基因变异。 需要指出的是，虽然目前胚系与体细胞变异解读标准是相互独立的，但在HRR基因变异解读的临床实践中通常需要联合应用两种解读标准。HRR基因通常缺乏热点突变，前列腺癌重要临床研究中的HRR基因变异解读主要参考胚系数据库或者经过胚系变异分级规则判定。因此，前列腺癌HRR基因体细胞变异或不能区分来源的肿瘤变异在临床意义分级之前，需先按照胚系解读标准对变异进行致病性判读，只有致病及可能致病性的变异才有可能被归为临床意义明确（Ⅰ级）或有潜在临床意义（Ⅱ级）。对于HRR基因胚系变异而言，评级为致病及可能致病性的变异对于前列腺癌患者的治疗决策与预后判断同样有非常重要的临床意义。 另外，HRR基因变异的解读基于当前对该变异的认识，随着数据库的完善、文献资料的更新以及临床试验的进展，变异解读有可能发生变更。不同基因、区域、位点、类型的HRR基因变异与肿瘤遗传易感性以及药物疗效之间更为精细的关联也需要更多数据的积累。 八、HRR基因检测报告 实验室出具的检测报告是临床分子诊断实验室、临床医师和患者沟通的桥梁，目前检测报告存在关键信息缺失、表述不清晰、重点不突出、非必要内容过多等问题。建议临床报告按照简洁清楚、重点突出、通俗易懂的原则呈现以下内容，核心信息在首页呈现，具体的变异解读和医学证据可以在后续展开。 1.患者和样本的基本信息：患者信息包括患者的姓名、性别、年龄、临床诊断、家族史；样本信息包括样本编号、样本采集时间、实验室接收时间、送检科室、送检医师、检测项目、样本类型、样本的处理过程等；肿瘤组织样本需说明取材部位、病理诊断及肿瘤细胞含量。 2.检测方法：需要对测序平台、捕获方法、检测范围、检测变异类型、检测局限性等进行说明，检测基因列表和局限性可在附录中具体描述。 3.检测结果：检测结果内容包括检测结果的整体描述、检出变异（变异位点及核苷酸/氨基酸改变）、变异类型、基因型（胚系突变）或变异丰度/拷贝数（体细胞突变）、变异的致病性分类或临床意义分级、简要用药指导建议等。对于胚系HRR变异，检测结果部分应报告变异的致病性分类，并列出在该受检者中发现的所有3~5类变异；对于体细胞HRR变异或不能区分变异来源的肿瘤HRR变异（仅送检肿瘤组织样本），检测结果部分应报告临床意义分级，并列出在该受检者中发现的Ⅰ~Ⅲ级变异。 4.基因变异位点详细解读：突变致病性及临床意义是通过对各种证据的汇总分析确定的，需要在此对参考的证据给予简要说明，并注明参考数据库及文献来源。在临床实践中，为了避免胚系与体细胞变异解读标准联用造成的检测报告撰写与阅读上的困扰，我们建议依据样本类型制定相应的HRR变异检测报告模板：（1）使用血液（白细胞）等正常细胞样本进行胚系变异检测时，推荐在报告中体现变异的致病性分类，对于前列腺癌患者还可考虑在临床意义注释部分补充说明其用药指导价值。（2）如果仅送检手术或穿刺获得的肿瘤组织样本或者血浆ctDNA检测样本（检测到的变异既可能是胚系变异，也可能为体细胞变异），推荐在报告中体现变异的临床意义分级。（3）如果送检的是肿瘤和正常细胞配对样本，应先明确变异是胚系变异还是体细胞变异，再根据变异类型在报告中体现变异的致病性分类（胚系变异）或临床意义分级（体细胞变异）。 5.临床意义注释：具体说明胚系变异的遗传易感风险、肿瘤变异的用药指导建议等。另外，检出胚系致病性/可能致病性变异时，应建议对受检者进行遗传咨询，对受检者的血亲进行遗传咨询以及变异检测；在肿瘤组织/ctDNA中检出致病性/可能致病性变异但不能区分胚系或体细胞来源时，应在报告显著位置建议进行胚系检测验证。 6.签名和实验室信息：需要列出实验操作、数据分析与报告撰写、报告复核人员的姓名及实验室联系方式、报告日期和版本号等。数据分析人员应具有临床医学、分子生物学或遗传学知识背景并经生物信息学培训经历。最终报告应由中级职称或硕士学位以上具有相关背景、经培训合格的本单位执业医师或者授权签字人（高级职称或博士学位）审核。 经专家组讨论，本共识建议血液白细胞样本检测报告模板见表3。 表3 血液白细胞样本检测报告模板 本共识建议的肿瘤样本检测报告模板见表4。 表4 肿瘤样本检测报告模板 本共识概述了前列腺癌中的HRR基因突变及其临床意义，并依据临床证据级别及专家意见一致程度，在HRR基因检测适用人群、样本选择、样本处理要求、检测技术、变异解读、检测报告等方面进行了推荐，以指导与规范中国前列腺HRR基因检测的临床应用。需要指出的是，前列腺癌精准诊疗领域进展迅速，随着高质量研究证据的不断积累及检测技术的不断进步，检测共识也需要不断更新和完善。 本共识推荐级别及参考依据见表5。 表5 本共识推荐的级别及参考依据 《前列腺癌同源重组修复基因检测及变异解读中国专家共识》编写组成员（按单位首字母拼音顺序排列） 北京大学第三医院病理科（贺慧颖）；北京大学第三医院泌尿外科（刘承）；北京大学第一医院泌尿外科（虞巍）；北京医院泌尿外科（刘明）；东部战区总医院病理科（饶秋）；复旦大学附属肿瘤医院病理科（周晓燕）；海军军医大学第一附属医院（上海长海医院）泌尿外科（高旭）；河南省肿瘤医院病理科（马杰）；江苏省人民医院病理科（张智弘）；山东大学齐鲁医院病理科（韩博）；上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿科（董柏君）；上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿科（薛蔚）；首都医科大学北京宣武医院病理科（滕梁红）；四川大学华西医院病理科（唐源）；四川大学华西医院泌尿外科（曾浩）；天津市肿瘤医院泌尿肿瘤科（姚欣）；中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院病理科（梁智勇，吴焕文）；中山大学孙逸仙纪念医院病理科（欧阳能太）；中山大学孙逸仙纪念医院泌尿外科（何旺，黄健）；中山大学肿瘤防治中心病理科（邵建永）；中山大学肿瘤防治中心泌尿科（李永红）
